Theodore Raymond Knight est né le 26 mars 1973, à Minneapolis, dans le Minnesota, USA.
Il a fait ses premiers pas en tant qu'acteur à l'âge de 5 ans en jouant le rôle de Tim dans un spectacle de Noël annuel.
T.R. Knight a été un membre de la compagnie de théatre Guthrie de Minneapolis. Il y jouait Richard Miller dans "Ah, Wilderness !," et Amadeus dans le film de Peter Shaffer "Amadeus."
Durant un stage à New York, il a joué Tim Allgood dans "Noises Off", Damis dans "Tartuffe", Joe dans "This Lime Tree Bower" et Brendan Hilliard dans "Anto Scattergood".
Il a reçu une nomination au Drama Desk dans la catégorie Acteur ayant fait une performance remarquable dans "Scattergood".
En 2002, il joue le rôle de Daniel dans le film "Garmento". Il interprète ensuite le personnage de Ryan Lemming dans la série "Charlie Lawrence" en 2003. Il apparaît dans un épisode de "Frasier" la même année et en 2004, joue le rôle de Neil Colby dans "Law and Order". Il apparaît également dans un épisode des "Experts" en 2004 et rejoint le casting de Grey’s Anatomy dès 2005 sous les traits de George O’Malley.
Malgré lui, il a été contraint de révéler au monde entier qu'il est homosexuel.